56
圆园18年3月
第39卷第5期
云oodResearchAndDevelopment食品研究与开发分离提取
柑橘皮中总黄酮提取工艺及降血糖活性的
试验研究
吴梅青,李俊雅,陈丹
(湘潭医卫职业技术学院,湖南湘潭411102)
摘
要:研究柑橘皮中总黄酮的提取工艺条件及其降血糖作用。以柑橘皮为原料,通过正交设计试验考察乙醇
浓度、料液比、提取时间对柑橘皮黄酮提取率的影响,确定最佳的提取工艺条件;采用四氧嘧啶腹腔注射法制造糖尿病小鼠模型,随机分为5组:二甲双胍阳性药物组,模型小鼠溶剂对照组和正常小鼠空白对照组,醇提物高、中、低剂量组,观察柑橘皮中总黄酮的降血糖效果。柑橘皮中总黄酮最佳提取工艺条件为:70%乙醇,料液比1颐20(g/mL),回流提取2次,每次2h,提取温度85益,总黄酮提取率为7.68%。动物试验结果表明,模型各组的血糖质量浓度升高,经灌胃以柑橘皮醇提物14d后,血糖浓度明显下降,而空白组小鼠的血糖值无明显变化。
关键词:柑橘皮;总黄酮;提取工艺条件;降血糖活性
StudyonExtractionTechnologyandHypoglycemicEffectofTotalFlavonoidsfromCitrusPeels
(XiangtanMedicineHealthVocationalCollege,Xiangtan411102,Hunan,China)
粤遭泽贼则葬糟贼:Theresearchaimedtostudyextractiontechnologyoftotalflavonoidsfromcitruspeelsanditshypoglycemiceffect援Usingcitruspeelsasrawmaterial,theeffectsofdifferentethanolconcentration,ratioofalloxanintraperitonealinjections援Bloodglucoseconcentrationofthemicewererandomlydividedintofivemethod,theeffectoftotalflavonoidsofcitruspeelonreducingbloodsugarwasobserved.Thebestextractflavonoidsfromcitruspeelsbyorthogonaldesign援Thediabeticmousemodelwasestablishedbythemethodofcomparisongroupinthenormalmice,thegroupsofhigh,mediumandlowdosealcoholextracts.Usingthissolidtoliquid,extractiontimeandextractiontimesweretakentooptimizeextractiontechnologyoftotal
WUMei-qing,LIJun-ya,CHENDan
groups:thegroupofmetforminpositivedrug,thecomparisongroupinthemodelmicewithsolvent,theblanktechnologywastodistillwith10times70%ethanol,solid-liquidratio1颐20(g/mL),refluxed2timesand
extractedfor2h.Theextractiontemperaturewas85益.Theextractionrateoftotalflavonoidswas7.68%.bloodglucoseconcentrationofmiceintheblankgroupwasnotvariedobviously.
Animalexperimentsshowedthat:bloodglucoseconcentrationofeachgroupinthemodelmicewasincreased援Afterlavagingwithalcoholextractsfor14d,bloodglucoseconcentrationwasdeclinedobviously.However,the运藻赠憎燥则凿泽:citruspeels;totalflavonoid;extractingtechnicalcondition;hypoglycemiceffect
引文格式:
吴梅青,李俊雅,陈丹.柑橘皮中总黄酮提取工艺及降血糖活性的试验研究[J].食品研究与开发,2018,39(5):56-59WUMeiqing,LIJunya,CHENDan.StudyonExtractionTechnologyandHypoglycemicEffectofTotalFlavonoidsfromCitrusPeels[J].FoodResearchandDevelopment,2018,39(5):56-59
糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病。长期血糖增高,大血
作者简介:吴梅青(1971—),女(汉),教授,硕士,研究方向:天然药物的研究与应用。
管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等,据世界卫生组织统计,糖尿病并发症高达100多种,是目前已知并发症最多的一种疾病,严重影响了患者的身心健康。而化学方法合成的抗糖尿病
分离提取
吴梅青,等:柑橘皮中总黄酮提取工艺及降血糖活性的试验研究
药物对人体副作用大,着手从天然产物中研制降血糖药物,是目前学者热衷研究的方向之一[1]。在治疗糖尿病的天然产物中,黄酮类成分扮演着重要的角色[2]。
柑橘皮作为传统的中药,其中的黄酮类物质含量丰富,主要包括黄烷酮、黄酮和多甲氧基黄酮等3类物质[3],其中以黄烷酮苷为主。现代药理研究表明,柑橘黄酮具有抗氧化、抗菌与抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂及增强免疫力等活性[4-8]。近年来对柑橘黄酮的药理作用研究较多,但对柑橘黄酮类物质的降血糖作用研究较少。本文对柑橘皮中总黄酮的乙醇提取工艺及辅助降血糖作用进行了研究,试验结果能为柑橘皮的进一步开发和应用提供依据。
1
1.1试验原料
材料
柑橘:购买于湖南芦溪县某农贸市场,产地为湖南芦溪县。
1.2
芦丁试剂
对照品(含量为92.8%,中国食品药品检
定研究院,100080-201407);四氧嘧啶(北京中生瑞泰科技有限公,型号:1122);盐酸二甲双胍片(深圳市中联制药有限公司);注射用生理盐水(天津药业焦作有限公司);乙醇、其余试剂、试药均为分析纯。1.3
UV2600仪器
学仪器有限公司双光;束BP211D紫外分赛光光度计多利斯分:析上天海天平(美十科万分之一):德国sartorius赛多利斯;XL-600B多功能粉碎机:永康市小宝电器有限公司;KQ3200DB数控超声波清洗仪:昆山超声仪器有限公司;DZF-6050型真空干燥箱:上海一恒科学仪器有限公司;ER-52AA优型血糖旋转蒸仪及发配器套:试上纸海。
亚荣生化仪器;强生稳豪倍1.4
雄试性验动SPF物级ICR小鼠,清洁级,4周~5周龄,体
重20g~25g,购买于湖南斯莱克景达试验动物有限公司,许可证号:SCXK(湘)2017-0002。
2
2.1
试验原料方法
将柑橘预洗处涤理
后剥皮,再把椪柑皮晾干后烘干至
恒重。采用多功能粉碎机粉碎,过60目筛,备用。
2.2
根据提取黄工酮艺易条件溶于的乙醇确定
57
等性质,该试验选择乙醇
回流提取法。为了确定柑橘皮中总黄酮的最佳提取工艺,参考了相关文献资料[9-11],结合笔者以往的研究经验,分析得出影响天然药物中总黄酮提取率的主要因素有乙醇浓度、溶剂用量、提取时间和提取温度。本试验采用乙醇浓度(%)、溶剂用量(倍)、提取时间(h)作为考察对象,设计三因素三水平正交试验优选最佳提取工艺条件。由于天然药物活性成分的提取次数一般为2次,所以本次试验设定提取次数为2次。每次提取的水浴温度均设定为85益[12]。因素水平表见表1。
表1因素水平表
Table1Thefactorandlevelexperiment
水平因素
1A乙醇浓度250/%B料液1比颐(/5g/mL)C提取时间/h3709011颐颐10201.5122.3
2.3.1
柑橘芦丁总标准曲线黄酮的测的定
精密称定芦丁对照品绘制[13]
5.46mg置25mL量瓶中,
加一定量无水乙醇溶解,冷却至室温,再加无水乙醇至刻度,得0.2184(mg/mL)的芦丁对照品溶液。
精密量取对照品溶液0、2、3、4、5、6、8mL,分别置25mL容量瓶中,各加无水乙醇补足至5.0mL,各加5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀,静置6min,再加10%硝酸铝溶液1mL,摇匀、静置6min,再4%氢氧化钠试液10mL,再加无水乙醇至刻度,摇匀,静置15min。以空白试剂作对照液,用双光束紫外分光光度计在510nm的波长处测定吸光度,以对照品质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标得到标准曲线:Y=13.495X-0.0196(R2光度;X为芦丁浓度,mg/mL。=0.9996),式中:Y为吸
2.3.2
按柑橘照2.2皮项中下总在黄不酮同条件下提取率计水算
浴提取得到的提
取液,每次提取液趁热过滤,合并提取液,浓缩、定容至250mL的容量瓶中。取5mL提取液,用无水乙醇定容至25mL容量瓶中,按“2.3.1”方法测定吸光度,平行试验3次,结果取平均值。查标准曲线,得到总黄酮浓度,即可计算柑橘皮中总黄酮提取率。
总黄酮提取率的计算公式:
吴梅青,等:柑橘皮中总黄酮提取工艺及降血糖活性的试验研究
分离提取
58
总黄酮提取率/%=
WXvC伊V伊1伊N000伊100(1)
式中:C为稀释液总黄酮浓度,mg/mL;V为提取液体积,mL;W为样品重量,g;v为测定的样品体积,mL;N为稀释倍数。2.4.12.4
柑橘称柑橘皮取2.1皮黄项总酮黄对小血糖影响试验下酮已粉的制备
碎的柑橘皮20g放入圆底
烧瓶中,按照2.2项下确定的最佳提取工艺条件提取2次,每次提取液趁热过滤,合并提取液;经旋转蒸发仪,在温度为65益下回收乙醇,回提后得到剩余液体约120mL,再经水浴蒸发,得浸膏;再将浸膏放于45益烘箱中干燥,得到粉末状柑橘皮70%乙醇提取物。2.4.2
对糖糖尿尿病小病小鼠鼠模模型型的的建建立
立参照文献[14-15]
方法并
稍做修改,方法如下:取ICR小鼠100只,雄性,体重为20g~25g,适应性饲养3d,称重。随机挑选12只小鼠作为空白对照组,其余小鼠禁食12h(自由饮水),200mg/kg剂量下腹腔注射四氧嘧啶生理盐水溶液(空白对照组注射等体积生理盐水),建立糖尿病动物模型。72h后再次禁食(不禁水)12h,于后尾静脉采血,血糖仪测定空腹血糖值,血糖值2.4.3
逸11.1(mmol/L)为糖尿病柑橘柑橘黄黄酮酮对糖对糖尿尿病小病小模型鼠鼠小模模鼠型型。
血糖血糖影响影响试试验验
参
照文献方法[16-17]并稍做修改,方法如下:选取糖尿病模型小鼠60只,按血糖值随机分成5组,即二甲双胍阳性组,模型组、柑橘皮70%乙醇提取物高、中、低3个剂量组。二甲双胍阳性组,将二甲双胍片碾碎成粉末状溶于生理盐水中,制成10.2mg/mL质量浓度的溶液,按0.1mL/g给与灌胃;柑橘皮70%乙醇提取物高、中、低3个剂量组给药浓度为:称取2.4.1成生理项盐下水制溶得液的,干按粉照5.00.2、(3.0mL/g、1.0)给g/kg予灌胃质量;浓度模型配组
和空白对照组给予等体积的生理盐水。每天灌胃给药1次,连续14d。分别在灌胃给药第7天及第14天于尾静脉取血,用血糖试纸及血糖仪测定其血糖质量浓度的变化。2.4.4
将试统验计数据学方输法
入电脑软件,采用SPSS15.0软件进行统计学分析。P<0.05为差异有显著性。
3
3.1
结果与分析
按提照取工2.3.2艺技术项下测条件
定柑橘皮中总黄酮的含量,
测定结果见表2。由表2可看出,各因素对柑橘皮中总黄酮得率的影响从大到小依次为乙醇浓度、提取时间、料液比。从各因素水平看,A2、B3、C3组合提取
率应最大。但此组合不在正交试验中,做验证试验。试验结果是:在该组合下,柑橘皮中总黄酮提取率为7.68%。由此优化出柑橘皮中总黄酮的最佳提取工艺为70%乙醇,料液比为1颐20(g/mL),回流提取2次,每次2h,提表取2温试验度设结果定及为分析表
85益。
Table2Testresultsandanalysistable
序号
因素
总黄酮提乙醇浓度/%
料液比(/g/mL)
提取时间/h
取率/%12503501:545011.515.045701::102025.736.3267077011:51.56.818901:27.62901:10:207.0115126.93k9
1k5.7090
1::10206.14
1.516.366.49
2k7.156.576.263R6.696.341.450.356.610.826.96
3.2
空腹血糖柑橘的总影响
黄酮对四氧嘧啶所致高血糖模型小鼠
柑橘总黄酮对四氧嘧啶所致高血糖模型小鼠空腹血糖值的影响见表3。由表3可以看出,柑橘黄酮对空白对照组小鼠的血糖几乎没有影响,也就是说对正常小鼠的血糖值几乎没有影响;阳性组(二甲双胍组)200mg/kg剂量能显著降低正常小鼠的血糖,阳性组与空白对照组相比较有显著差异性(P<0.05);柑橘皮70%乙醇提取物高、中剂量组相比较无显著性差异(P>0.05);柑橘皮70%乙醇提取物高、中剂量组与阳性药物相比较无显著性差异(P>0.05相比较);柑橘无明显皮差异70%,乙醇可能提是取剂物量低太剂低量导组与致效模果型不组是
很明显。试验结果表明,柑橘皮70%乙醇提取物对分离提取
吴梅青,等:柑橘皮中总黄酮提取工艺及降血糖活性的试验研究
表3柑橘总黄酮对糖尿病模型小鼠血糖值的影响
Table3TheeffectoftotalflavonoidsformcitrusonbloodsugarlevelofDiabeticMice
59
给药14d血糖(/mmol/L)
5.5710.219.8210.5811.7412.46
组别空白组模型组阳性组醇提物-高醇提物-中醇提物-低
数量/只121212121212
剂量(/g/kg)
000.2531
给药前血糖(/mmol/L)
5.5615.2416.1415.0715.9214.86
给药7d血糖(/mmol/L)
5.4813.1613.3413.4213.8613.58
四氧嘧啶所致的糖尿病小鼠模型有一定的辅助降血糖作用,而且有剂量的依赖性。
4
讨论与结论
[5][6][7]
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柑橘类黄酮是一系列具有显著生物活性的黄酮类化合物所组成的混合物,不但具有独特的芳香性、良好的水溶性和显著的药理作用,而且是一类新发现的营养素。柑橘皮作为传统的中药,其辅助降血糖的作用受到了研究者的关注
[18-19]
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DDP细胞凋亡的试验研究[J].时珍国医国药,2012,23(8):1925-1926
。该研究结
果也表明,柑橘皮中总黄酮具有降低四氧嘧啶所致高血糖模型小鼠血糖的作用。目前,大致认为柑橘黄酮降血糖机制主要是与抗氧化性正相关的自由基、脂质过氧化和低密度脂蛋白氧化性改变有关
[19-20]
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,
而且试验研究还停留在在动物试验阶段。关于柑橘作用机理和作用靶点还黄酮降血糖的浓度与范围、亟待进一步研究。
除了对总黄酮的降血糖作用外,该试验还研究了柑橘皮中总黄酮的提取工艺,得到其最佳提取工艺条件为:70%乙醇,料液比为1颐20(g/mL),回流提取2次,每次2h,提取温度85益,在此最佳工艺条件下柑橘皮总黄酮提取率7.68%。至于提取次数和提取温度对柑橘皮中总黄酮的提取率的影响也有待进一步研究。
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金晶,罗爱民,杨艳,等.橘皮中黄酮类化合物的提取工艺及抗
收稿日期:2017-08-31
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