D01:10.3969/j.issn.l005-1678.2017.01.088
FPIA法与HPLC法监测癫痫患儿外周血丙戊酸钠浓度差异的比较
张浩1A,李金德2,周台玲1
(1.浙江舟山医院检验中心，浙江舟山316000; 2.上海浦东新区中医医院检验科，上海200000)
[摘要]目的探讨比较荧光偏振免疫分析法（FPIA)与高效液相色谱法（HPLC)监测癫痫患儿外周血丙戊酸钠浓度的差异。方法选
取2014年2月~2016年6月浙江舟山医院服用丙戊酸钠治疗的癫痫患儿87例，于末次用药后次日清晨采集患者空腹肘静脉血，分别采用
FPIA法和HPLC法检测对血清样本丙戊酸钠浓度进行检测，观察、比较2种检测手段的测定结果、相关性及一致性。结果FPIA法检测患
儿外周血丙戊酸钠的日内及日间RSD均<5%,回收率90%-110%,精密度及准确度较高；HPLC法检测患儿外周血丙戊酸钠的日内及日 间RSD均<5%,回收率90%~ 110%之间，精密度及准确度较高；以HPLC法测定值（X)与FPIA法测定值（Y)所作线性回归方程为：
Y=0.8355X+1.8231，相关系数^0.914, 2种检测结果呈正相关关系；采用FPIA法测得的丙戊酸钠血药浓度明显低于HPLC法测得的丙戊酸钠
血药浓度，差异具有统计学意义（尸<〇.〇5) ; Bland-Altman偏差图结果显示，HPLC法测定血药浓度比FPIA法高7.2ng/mL。结论FPIA法 与HPLC法盟测癫痫患儿外周血丙戊酸钠浓度的精密度及准确度均较高，且相关性较好，但2种方法的检测结果具有明显差异，HPLC法检 测结果高于FPIA法，需根据临床情况选择判断。
[关键词]荧光偏振免疫分析法；高效液相色谱法；癫痫；丙戊酸钠；血药浓度 [中图分类号]
R741
[文献标识码]
A
A comparative study of Sodium valproate concentration in peripheral
blood monitoring by FPIA and HPLC in epilepsy children
ZHANG Hao'LI Jin-de'ZHOU Tai-ling1
(l.Zhejiang Zhoushan Hospital Inspection Center,Zhoushan 316000,China;2.Department of Laboratory MedicinesShanghai Pudong
New Area Traditional Chinese Medicine Hospital,Shanghai 200000,China)[Abstract] Objective To investigate the comparation of sodium valproate concentration in peripheral blood monitoring by fluorescence
polarization immunoassay method (FPIA) and high performance liquid chromatography method (HPLC) in epilepsy children.Methods 87 cases of epilepsy children received Sodium valproate treatment in our hospital from February 2014 to June 2016 were selected,fasting venous blood of elbow vein were collected the next morning after last medication, blood concentrations of Sodium valproate in serum samples were detected by FPIA method and HPLC method respectively,the correlation and consistency of results of the two methods were observed and compared-Results The intra day and inter day RSD of Sodium valproate concentration in peripheral blood in epilepsy children detected by FPIA were <5%,the recovery rate was 90%-110%,the precision and accuracy were high;The intra day and inter day RSD of Sodium valproate concentration in peripheral blood in epilepsy children detected by HPLC were < 5%,the recovery rate was 90%-110%,the precision and accuracy were high; the linear regression equation between determination value of HPLC method (X) and determination value of FPIA method (Y) was:Y=0.8355X+l.8231,correlation coefficient f=0.914,the detection results were positively related;the Sodium valproate blood concentration detected by FPIA was significantly lower than that detected by HPLC method, the difference was statistically significant (P<0.05);Bland-Altman deviation chart results show that determination of blood drug concentration by HPLC method was higher than that of FPIA method by 7.2ng/mL.C〇nclusi〇n The precision and accuracy of sodium valproate concentration in peripheral blood monitoring by FPIA method and HPLC method were all high, and the correlation was good, but the detection results of the two methods were significantly different,the detection result of HPLC method was higher than that of FPIA method,need to choose and judge according to the clinical situation.
[Keywords] fluorescence polarization immimoassay method;high performance liquid chromatography;sodium valproate;epilepsy;blood drug
concentration
癫痫是小儿神经系统常见慢性疾病，是指由于大脑神 经元突发异常放电导致的短暂大脑功能障碍[1]。儿童癫痫发 病率约为成年人的10〜15倍[2],占癲痫患者的2/3左右，具 有突然、反复发作的特点，给患儿健康及生长发育造成严
作者简介：张浩，通信作者，男，本科，检验技师，研究方向：生化、 细菌、免疫检验，E-mail： autzh0628@163.com。
重影响，目前临床上首选药物治疗[3]。丙戊酸钠是传统的广 谱抗癫痫药物，主要通过升高脑内Y-氨基丁酸（GABA)浓 度，同时增强突触后对GABA的反应，以抑制神经元兴奋[4]，达到治疗癫痫的目的。癫痫患儿需要长期使用控制病情 进展和疾病发作，但是丙戊酸钠治疗窗及安全范围狭窄、 患儿吸收代谢的个体差异也较大、药物不良反应复杂[5]，再
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中国生化药物杂志2017年第1期总第37卷论著临床与药物
加上患儿发育尚不完全，若血药浓度过高容易对患儿各系 统造成严重损伤，药物浓度不足临床疗效不理想，因此， 采用合理的方式监测丙戊酸钠血药浓度，实现个体化给药 尤为重要。荧光偏振免疫分析法（FPIA)与高效液相色谱 法（HPLC)均为监测丙戊酸钠血药浓度的常用方法，本次 研宄主要对FPIA法与HPLC法监测癲痫患儿外周血丙戊酸钠 浓度的差异进行比较，现报告如下。1
资料与方法
一般资料选取浙江舟山医院2014年2月〜2016年6月
美仑生物技术有限公司，规格：>98%, CAS: 1069-66-
5) 37.4mg,采用0.2mol/L氨水溶解稀释至浓度为0.752mg/
mL,作为丙戊酸钠标准液；取环己烷羧酸（安徽宏喆生 物科技有限公司，规格：99.5%, CAS:98-89-5) 25.1mg, 采用0.2mol/L氨水溶解稀释至浓度为0.2008mg/mL,作 为内标标准液；取to-溴苯乙酮（co-溴苯乙酮（规格：
98%, CAS:70-11-1),购自上海晶都生物技术有限公司） 125.4mg,采用乙腈溶解稀释至浓度为5.016mg/mL,作为衍
1.1
生化试液。3种溶液均置于2-8°C冰箱保存备用③样品处理 与色谱行为：取5mL离心管，加入5〇nL血清样本+5〇nL内 标标准液+lmol/L硫酸溶液10〇nL,充分混匀，滴加正己烷
4mL,充分萃取分层后取10pL上清液，移至另一试管，滴
服用丙戊酸钠治疗的癫痫患儿87例，患儿均符合2013年中 华医学会儿科学分会神经学组《儿童癫痫长程管理专家共 识》关于癫痫的诊断标准[6]，经脑电图检查确诊，其中男 性47例，女性40例，年龄6〜14岁，平均（6.46±4.20)岁， 平均体质量（26.07±7.38) kg,平均体质量指数（BMI) (18.05±5.34) kg/m2,所有患儿均长期规律服用丙戊酸钠 治疗。本研宄经患儿家属签订知情同意书，经本院伦理委 员会审核同意。1_2方法
1.2.1血液样本采集：于末次服药后次日清晨，采集所 有患儿的空腹肘静脉血3mL,采用Allegra X-12台式离心 机（美国贝克曼库尔特公司）分离血清，3500r/min离心 lOmin,将分离得到的血清平均分为2份，分别用于FPIA法 与HPLC法检测。
1.2.2 FPIA法测定丙戊酸钠浓度：①标准曲线制作：采
加衍生化试液4〇nL+三乙胺2〇nL,漩涡混匀，于63°C水浴 箱衍生，lOmin后置于45°C水浴箱蒸干，滴加甲醇0.3mL， 溶解后取200pL置于另一试管中，滴加冰乙腈60〇nL,采用 离心机12000r/min离心10min,取上清液过滤，自动进样器 进样20叫，微孔滤膜孔径为0.25nm。④标准曲线制作：配 制质量浓度为 12.5、25.1、37.6、50.1、75.2和 100.3ng/mL 的丙戊酸钠标准液，按1.2.3③的方法进行操作，以丙戊酸 钠浓度（C)对丙戊酸钠峰高与内标衍生物峰高之比（Y) 进行线性回归，绘制标准曲线。⑤精密度及回收率检测： 配制质量浓度为低（50.1ng/mL)
、
中（62.7ng/mL)
、
高
(75.2ng/L) 3个浓度的丙戊酸钠血清质量控制样品各6份，
连续测定3d,计算日内、日间精密度（RSD)以及回收 率。
1.2.4 2种方法测定丙戊酸钠血药浓度相关性及差异性比 较：分别计算两种方法测定的外周血丙戊酸钠血药浓度， 并进行比较，观察两种方法测定结果的相关性和差异性。
1.2.5 2种方法测定丙戊酸钠血药浓度的一致性比较：绘制 2种方法测定结果的Bland-Altman偏差图，对2种方法测量结
用浓度为〇Hg/mL、12.5ng/mL、25.0(ig/mL、50.0|ig/mL、
10〇Hg/mL、150.〇ng/mL的丙戊酸钠检测专用标定液来标
定，通过TdxFlx荧光偏振免疫分析仪（美国Abbott公司） 拟合标准曲线。②样本药物浓度测定：取150叫患儿血清加 入样品孔中，按照丙戊酸钠检测试剂盒说明书步骤依次将 试剂加入相应盖槽内，采用TdxFlx荧光偏振免疫分析自动 检测丙戊酸钠浓度。丙戊酸钠检测试剂盒购自美国Abbott 公司。③精密度及回收率检测：取质量浓度为低（37.5pg/ mL)
、
果均值进行比较，观察测量结果的一致性。
1.3统计学方法所有数据采用SPSS17.0统计学软件包进行 分析，符合正态性的计量资料采用S±s”表示，数据对比予以 配对样本術验，相关性分析采用Deming回归法，以P<0.05表 示差异具有统计学意义。2
结果
中（75.〇ng/mL)
、
高（125.〇ng/L) 3个浓度的丙戊
酸钠血清质量控制样品各6份，连续测定3d,计算日内、日 间精密度（RSD)以及回收率。
1.2.3 HPLC法测定丙戊酸钠浓度：①色谱条件：Kromasil C18色谱柱（250mmx4.6mm, 5nm);流动相为甲醇：水 (75:25);波长：24nm;流速：1.0mL/min,柱温：30°C。 Dionex U-3000高效液相色谱仪购自美国赛默飞世尔科技 公司产品；②标准液配制：取丙戊酸钠（标准品，大连
2.1 FPIA法检测丙戊酸钠的RSD及回收率结果显示，FPIA 法检测患儿外周血丙戊酸钠的日内及日间RSD均<5%，回收 率90%〜110%,精密度及准确度较高。见表1。
表1 FPIA法检测丙戊酸钠的RSD及回收率试验结果G±s, «=6)
Tab. 1 Results of RSD and recovery of sodium valproate by FPIA(x 土s,«=6)
浓度（Hg/mL)
37.575.0125.0
曰内
测定值（Hg/mL)
38.85±1.3277.85土3.03 126.98±5.22
RSD (%)
3.43.94.1
曰间
回收率（％)
103.6103.8101.6
测定值（pg/mL)
38.76±1.1278.93±2.44126.07±4.16
RSD C%)
2.93.13.3
回收率（％)
103.4105.2100.9
-293-
论著临床与药物中国生化药物杂志2017年第1期总第37卷
2.2 HPLC法检测丙戊酸钠的RSD及回收率结果显 示，HPLC法检测患儿外周血丙戊酸钠的日内及日间
RSD均<5%,回收率90%〜110%,精密度及准确度较 高。见表2。
表2 HPLC法检测丙戊酸钠的RSD及回收率（I±s, «=6)
Tab.2 Results of RSD and recovery of sodium valproate by HPLC method^ ±s,»=6)
浓度（Hg/mL)
曰内
测定值（Jig/mL)
曰间
回收率（％)
测定值（pg/mL)
RSD (%)
4.14.54.3
RSD (%)
3.5
3.53.9
回收率（％)
50.162.775.249.85±2.0563.57±2.8673.79±3.14
99.5101.498.1
48.97±1.7263.26±2.2374.58i2.8997.7100.999.2
2.3 FPIA法与HPLC法检测丙戊酸钠血药浓度结果相关 性分析对每一个血液样本，以HPLC法测定值为X轴，以 FPIA法测定值为Y轴，据此绘制散点图，得到的线性回归 方程为：Y=0.8355X+1.8231,相关系数/=0.914,表明2种检 测方法的检测结果呈正相关关系。见图1。
oooooo
3讨论
儿童癫痫的发病率近年来不断上升，给患儿及其家属
造成严重影响。丙戊酸钠为一线抗癫痫药物，属于脑内 GABA转氨酶抑制剂，能够抑制GABA分解代谢，同时提高 谷氨酸脱羧酶活性，促进GABA生成，增加GABA含量， 还能增强突触后膜对GABA的敏感性，从而降低神经兴奋
2 0 8
性，阻止异常放电的扩散，对各型小发作、失神发作、大 发作、肌阵挛性发作、混合型癫痫、惊厥等均有显著治疗 效果[7]。关于丙戊酸钠治疗儿童癫痫的安全性也受到广泛 关注，研宄显示，丙戊酸钠的不良反应发生率在患儿中较 高，累及血液、神经、消化、皮肤及内分泌等多个系统[8], 其发生率与药物血药浓度有关。因此，治疗过程中监测丙
50
HPLC法
测定值
罠坭
6 4 2
b.
2.4 FPIA法与HPLC法检测丙戊酸钠血药浓度比较通过 FPIA法测得的丙戊酸钠血药浓度为（63.15士9.02)呢/mL， 通过HPLC法测得的丙戊酸钠血药浓度为（72.53±10.74) 昭/mL，FPIA法测定值明显低于HPLC法，差异具有统计学 意义（i><0.05)。
2.5 FPIA法与HPLC法检测丙戊酸钠血药浓度结果一致性 分析FPIA法与HPLC法对同一样本测定值均值为横坐标， FPIA法与HPLC法对同一样本测定值之差为纵坐标，95%置 信区间（CI)为-9.4〜23.9Kg/mL, HPLC法测定血药浓度较 FPIA法高7.2pg/mL。见图2。
^1^ SD_
23.9
vld100（Mg/mL)
戊酸钠血药浓度对于减少不良反应发生和保证用药安全意 义重大。FPIA法与HPLC法是监测丙戊酸钠血药浓度常用 方法，FPIA法属于定量免疫分析技术，样本中加入已知量 荧光素标记的小分子抗原，与待测丙戊酸钠竞争性的结合 抗体形成大分子复合物，蓝偏振光照射后，荧光素标记物 发出偏振荧光，通过检测荧光偏振程度来分析丙戊酸钠浓 度，具有自动化程度高、操作简便、分析周期短、快速等 优点，但是该方法具有测定药物的品种有限、专属性弱、 价格昂贵等不足，且无法进行新药研究[9_1°]。HPLC法是色 谱法的重要分支，主要通过高压输液系统将混合溶剂、样 品等流动相泵入色谱柱中，色谱柱中含有固定相，各种成 分在色谱柱内被分离开来，检测器将不同成分信号转化为 色谱图，通过对色谱图的分析来检测样品中丙戊酸钠的浓 度[11]，该检测方法具有检测灵敏度及准确度高、可重复性 好、专属性强的特点，但是操作过程复杂，技术难度大、 测定周期长[12]。
在本研宄中，笔者选取长期规律服用丙戊酸钠治疗的
平均值
图1 FPIA法与HPLC法测定值散点图
Fig. 1 Scatter plot of FPIA and HPLC
癫痫患儿87例作为研宄对象，分别采集外周静脉血样本， 通过FPIA法与HPLC法分别检测血液样本中丙戊酸钠浓度，
V〇
-10
结果显示，FPIA法、HPLC法检测患儿外周血丙戊酸钠的日 内及日间RSD均<5%，回收率均为90%〜110%，精密度及 准确度较高。资料显示，生物标本分析方法所得的RSD应
-15
0
20
40
60
80
100
120
140
160
控制在15%以内本研宄2种方法所得RSD均<5%,表明 PIA法与HPLC法检测癫痫患儿外周血丙戊酸钠血药浓度准 确度高，可用于临床监测。
采用线性回归对FPIA法与HPLC法检测结果相关性进行
-
HPLC和FPIA的平均值
图2 FPIA法与HPLC法测定值Bland-Altman偏差图
Fig.2 Deviation map of FPIA and HPLC method Bland-Altman
294-
中国生化药物杂志2017年第1期总第37卷论著临床与药物
[14] 王晓秋，温怀凯，朱光辉，等.FPIA法和HPLC法监测丙戊酸血药浓
分析，以HPLC法测定值为X轴，以FPIA法测定值为Y轴， 得到的线性回归方程为：Y=0.8355X+1.8231,相关系数 r=0.914,检测结果呈正相关关系，表明FPIA法与HPLC法 具有良好的相关性，这与王晓秋等[14]和赵明明等[15]的研宄 结果相一致。采用配对样本t检验对2种方法测得的丙戊酸 钠血药浓度进行比较，结果显示，FPIA法测定值明显低于 HPLC法（尸<0.05);进一步通过Bland-Altman偏差图对检 测结果的一致性进行更为直观的反映，结果显示，HPLC法 测定血药浓度较FPIA法高7.2ng/mL (95%CI: -9.4〜23.9ng/ mL),表明FPIA法与HPLC法测定结果相关性良好，但是 测定值具有显著差异，且HPLC法的测定值较高，这可能是 由于HPLC法手动操作过程复杂、反应繁琐、操作者技能水 平不稳定等因素，增加了误差，在临床应用中应注意此种 差异，综合考虑各方面情况，选择合适的监测方法。
综上所述，FPIA法与HPLC法监测癫痫患儿外周 血丙戊酸钠浓度的精密度及准确度均较高，且相关性 较好，但2种方法的检测结果具有明显差异，HPLC法 检测结果高于FPIA法，需根据临床情况选择判断。0
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(编校：苗加会）
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