1和IL-lp的影响
作者：姜希娟赵桂峰卢斌，杨琳范英昌
【摘要】目的观察丹酚酸B和丹参酮IIA对肿瘤坏死因子（TNF-a )诱导 的血管平滑肌细胞（SMC)白细胞介素-1(3 (IL-lp )和单核细胞趋化蛋白-1
(MCP-1)的影响，探讨丹参单体抗动脉粥样硬化（AS)的作用机制。方法体
外培养大鼠主动脉SMC; RT-PCR法检测SMC MCP-1 mRNA的表达；放免法检测 SMC培养上清IL-lp的水平。结果TNF-a促进SMC MCP-lmRNA的表达，提高 IL-1P水平(P值均〈0.01)。两种丹参单体均抑制上述因子的表达，其中，对于 抑制MCP-lmRNA的表达以丹参酮IIA效果更佳。结论丹参单体抗AS作用的机 制之一是抑制炎症相关因子的表达，丹参酮IIA抗炎效果优于丹酚酸B。 【关键词】肿瘤坏死因子；单核细胞趋化蛋白1;白细胞介素-lp ;丹 酚酸B;丹参酮IIA
Effect of salvia miltiorrhiza monomer on expression of monocyte chemotactic protein-1 and interleukin-l(3 in cultured rat vascular smooth muscle cells induced by tumor necrosis factor a
[Abstract] Objective To observe the effect of salvianolic acid B and tanshinone IIA on monocyte chemotactic protein-1 and interleukin-ip in cultured smooth muscle cells induced by TNF~a and to investigate the molecular mechanism of salvia miltiorrhiza monomer against atherosclerosis. Methods Rat aortic smooth muscle cells (SMC) were cultured, the mRNA expression of MCP-1 was observed by RT-PCR. Interleukin-lp was measured by radioimmune assay
methods. Results The expression of MCP—1 mRNA was stimulated by TNF- a and IL-lp was significantly increased (P<0. 01) . Both of the
salvia miltiorrhiza monomer markedly reduced the expression of MCP-1 mRNA and IL—ip , compared with control group(P<0. 01 and P< 0. 05 respectively ). Tanshinone IIA had better effect in the expression of MCP-1 mRNA than salvianolic acid B. Conclusion One of the molecular mechanism of salvia miltiorrhiza monomer resists atherosclerosis was inhibition expression of inflammation-related factor in SMC. Tanshinone IIA had better effect in anti-inflammation than salvianolic acid B.
【Key words】 tumor necrosis factor a ; monocyte chemotactic protein-1; interleukin-ip ； salvianolic acid B； tanshinone IIA
丹参是临床防治动脉粥样硬化（AS)的常用药物，它含有多种有效成分， 可以通过不同途径达到防治AS的目的。但是，丹参成分复杂，主要分为水溶性 成分和脂溶性成分，推测不同有效成分的靶点有所不同。其中丹酚酸B是其主
要水溶性成分，而丹参酮IIA是其主要脂溶性成分。为了阐明二者抗AS的作用 靶点，我们用体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（SMC)，观察丹酚酸B和丹参 酮IIA对TNF-a诱导的IL-lp和MCP-1的影响，为其抗AS作用提供新的理论 依据。
1材料
1. 1主要试剂DMEM/F12培养基（GIBCO)、胎牛血清（GIBCO)、
VSMCa -actin单克隆抗体（日本长野癌症研究中心惠赠）。总RNA提取试剂盒、 lOObp DNA LADDER (清华天为时代）、MCP-1引物（中科院华大基因公司）、 P —actin引物、RT-PCR试剂盒（大连宝生物公司）、IL_lp放免分析试剂盒 (北京东亚放免技术研究所）^
1.2主要仪器和设备超净工作台、C02恒温培养箱（TC 2323美国
SHLAB)、酶标仪（TACAN SPECTRA III)、倒置显微镜（XD-101 98010)、PCR 仪（HYBAID)、核酸蛋白分析仪（DU530 BECKMAN)、台式高速离心机 (HERAEUS 公司 biofuge)、电泳仪(DYY-III-8B 北京六一仪器厂）、Bio
imaging system (SYNGENE公司）Y放射免疫计数器（GC-400型，中国科技大 学科技实业总公司中佳光电仪器分公司）等。
1.3实验用药丹酚酸B、丹参酮IIA (标准品，科翔生物科技有限公司） 和大鼠TNF-a (英国PEPR0TECH公司）。
2方法
2.1大鼠动脉平滑肌细胞培养与鉴定选用清洁级Wistar大鼠，雌雄不 限，体重150g左右（购于军事医学科学院四所）。动物脱臼处死，无菌条件下 将主动脉取出，立即放入D-hanks液中，洗去残留血迹，剔除血管外膜纤维脂 肪层，刮除内膜，并反复冲洗血管。将血管剪成lmm2左右小块，均匀接种于 25cm2培养瓶内，37°C恒温培养箱内干孵1.5〜2h后，每个培养瓶内加入5ml 含20%胎牛血清的DMEM/F 12培养液。培养5天后细胞从组织块内长出，并更 换新鲜培养液继续培养，10天后，细胞长成“峰”、“谷”交错的致密细胞层 时，进行传代。实验采用第四代细胞。鉴定：根据细胞形态（典型的梭形，可 重叠生长至多层，高低起伏形成“峰”、“谷”交错状）和VSMC a -actin免 疫组化染色（培养细胞呈明显的胞浆阳性表达）。
2.2造模及分组方法取生长良好的平滑肌细胞，换用无血清培养基培养 12h，进行同步化后，分别进行如下处理。 2.2.1正常组（N) 2.2.2模型组（M) TNF-a 作用 6h。
采用无血清培养基继续培养8h。
采用无血清培养基继续培养2h后，再加入lOng/ml
2.2.3丹酚酸B组（B) 加入lmg/L丹酚酸B预处理2h后，再加入 10ng/ml TNF-a 作用 6h。
2.2.4丹参酮IIA组（IIA) 加入2mg/L丹参酮IIA预处理2h后，再加
入 10ng/ml TNF-a 作用 6h。
2. 3指标检测
2. 3. 1 RT-PCR法检测动脉平滑肌细胞MCP-1 mRNA的表达
2. 3. 1. 1总RNA提取采用异硫氰酸狐一步法（AGPC)，A260/A280>1. 8， RNA置于-70°C备用。
2.3. 1.2转录反应（RT) 从-70°C取出RNA进行反应。参数：42°C、 30min, 99。。、5min, 5°C、5min0
2.3. 1.3 PCR反应弓丨物序列，看家基因p -actin,上游引物 5' TTGTAACCAACTGGGACGATATGG 3r，下游引物
5 , GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG 3; ； MCP-1,上游引物 5' CAGGTCTCTGTCACGCTTCT 3',下游引物 5 , AGTATTCATGGAAGGGAATAG 3'。
参数：94°C预变性 2min, 94°C、30s, 55°C、30s，72V, lmin, 30 次循环。
2. 3. 1. 4 MCP-lmRNA表达分析各样品取10|J 1 PCR扩增产物，进行2%琼
脂糖凝胶电泳，结果拍照（图1)保存并在Bioimaging凝胶成像系统上进行吸 光度扫描（I0D)分析，以各样品MCP-1条带I0D和相应的(3 -actin条带的 I0D比值表示MCP-lmRNA表达的强弱。
2.3.2培养平滑肌细胞上清IL-1P水平的测定取细胞上清液采用放射 免疫平衡法测定IL-lp水平，操作按试剂盒说明书进行。
2.4统计学方法SPSS11.0进行方差分析，组间比较，q检验。 3结果
3. 1丹参单体对TNF-a损伤血管平滑肌细胞MCP-1 mRNA表达的影
响通过RT-PCR发现：TNF-a诱导SMC MCP-1 mRNA表达，与对照组相比差异 有显著性，P<0.01。丹参酮IIA和丹酚酸B对上述因子的表达存在显著性抑制 作用，与模型组相比，P值分别<0.05和<0.01。其中，丹参酮IIA对MCP-1 mRNA表达的抑制作用强于丹酚酸B，P<0. 05 (表1，图1)。图1各组平滑肌 细胞MCP-1 mRNA的表达（由左向右：N、B、M、IIA)表1丹参单体对TNF- a损伤SMC MCP-1 mRNA表达的影响（略）注:与模型组比较：**P<0.01, *P<0. 05 ；与丹参酮IIA组比较,好〈0. 05
3.2丹参单体对平滑肌细胞炎症介质IL-lp的影响结果显示，TNF-a
诱导SMC IL-1(3表达，与对照组相比差异有显著性，P〈0.01。丹参酮IIA和丹 酚酸B降低SMC上清IL-lp水平，与模型组相比，P值分别<0.05和0.01，丹 参酮IIA和丹酚酸B之间差异没有显著性，P>0.05 (表2)。表2丹参单体对 平滑肌细胞炎症介质IL-lp表达的影响（略）注：与模型组比较，**P<0.01， *P<0. 05
逆
4讨论
AS被视为一种特殊类型的炎症，单核细胞粘附于血管壁并穿入内皮下形成 泡沫细胞是其重耍形态学特征。单核细胞进入血管内膜下是AS早期事件并贯穿 其全过程，MCP-1是介导上述过程实现的主要因子[2, 3]。MCP-1在正常血 管壁中几乎未表达，而在AS不同演变时期中MCP-1表达均有升高。
虽然在正常情况下，SMC不产生MCP-1，但是在AS发展过程中，SMC不仅 可作为MCP-1的效应细胞，而且还可自行合成与分泌MCP-1而影响其他细胞的 功能[4]。动物实验发现[5]，不同阶段AS病变组织中均有大量MCP-lmRNA 表达，其中VSMC内MCP-1及MCP-1受体mRNA表达呈阳性；并且随着病变时间 延长、病变程度加重，MCP-1蛋白及其mRNA的表达均逐渐增强。MCP-1是VSMC 的促分裂因子，它通过PKC或增强细胞外Ca2+内流而促进VSMC增殖和迁移 [6]。在病理状态多种物质及细胞因子（如IL-lp )可以诱导SMC分泌MCP-1, 从而直接或间接地参与AS形成。而吴强[7]等用逆转录病毒表达载体介导反 义MCP-1转基因表达，能减少MCP-1表达并抑制单核细胞在动脉内膜粘附，为 AS防治提供了一个新的研究线索。
另外，VSMC可通过自分泌和旁分泌方式释放细胞因子IL-1,而且IL-lp 的水平远高于IL-la。IL-ip具有多种生物学功能，它不仅能作用于血管内皮 细胞，诱导其MCP-1和VCAM-1的表达，而且能与PDGF或单核细胞源性生长因 子共同作用促进VSMC增生。以浓度和时间依赖方式诱导单核细胞和中性粒细胞 对VSMC的粘附[8]。动物实验表明IL-lp对兔主动脉VSMC MCP-1的蛋白分 泌和mRNA表达具有明显的诱导作用[9]。因此，推断IL-1(3的表达增加可 以间接促进MCP-1的表达。
本实验离体培养大鼠VSMC，采用炎症反应主要调节因子TNF-a进行干预, 通过RT-PCR法检测发现SMC MCP-lmRNA表达增加，SMC培养上清IL_lp水平 升高，与以往报道相一致[5]。丹参酮IIA和丹酚酸B对上述因子的表达具有 明显抑制作用，其中以脂溶性成分丹参酮IIA的效果更好。另外，通过放免法 发现，两种丹参单体对IL-lp也有抑制效应，而且与对MCP-1的影响相一致， 推断丹参单体可能通过抑制IL-lp达到间接抑制MCP-1的目的。由此可见丹参 单体具有抑制炎症因子表达的作用，其抗AS的机制之一可能是通过抑制炎症反 应达到抑制SMC增殖和单核细胞趋化等效应，达到减缓AS发生发展的目的；结 果同时提示丹参成分复杂，其不同成分对上述炎症因子的影响不尽相同，其中 以脂溶性成分丹参酮IIA的效果更好。
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