(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105925684 A(43)申请公布日 2016.09.07
(21)申请号 201610317589.7(22)申请日 2016.05.12
(71)申请人 张理义
地址 213001 江苏省常州市天宁区和平北
路55号(72)发明人 张理义
(74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限
公司 31253
代理人 金波(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C40B 40/06(2006.01)
(54)发明名称
一种用于焦虑症诊断的lncRNA标志物、试剂盒及基因芯片(57)摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于焦虑症诊断和疗效评估的lncRNA标志物及试剂盒。本发明提供了一种用于焦虑症诊断的lncRNA标志物，包括NONHSAT078768、NONHSAT029028、NONHSAT101077、NONHSAT031726、TCONS_l2_00010607和NONHSAT131696，上述六种lncRNA的引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示；还提供了用于上述六种lncRNA的探针，探针序列如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18所示。本发明还提供了于一种评估抗焦虑症药物疗效的lncRNA标志物。本发明的有益效果在于首次提供了焦虑症生物标记物和评估抗精神病药物疗效的生物标记物。经临床验证之后，具有较高的特异性和敏感值，有较高的诊断参考价值，lncRNA作为焦虑症特异性生物标记物将带来焦虑症诊断及治疗的革命性改变。
权利要求书2页 说明书9页序列表5页 附图2页
CN 105925684 ACN 105925684 A
权 利 要 求 书
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1.一种用于焦虑症诊断的lncRNA标志物，其特征在于所述标记物包括NONHSAT078768、NONHSAT029028、NONHSAT101077、NONHSAT031726、TCONS_l2_00010607和NONHSAT131696六种lncRNA的组合。
2.一种焦虑症诊断试剂盒，其特征在于能够测定血液中的NONHSAT078768、NONHSAT029028、NONHSAT101077、NONHSAT031726、TCONS_l2_00010607和NONHSAT131696六种lncRNA的含量。
3.如权利要求2所述的焦虑症诊断试剂盒，其特征在于上述试剂盒含有NONHSAT078768、NONHSAT029028、NONHSAT101077、NONHSAT031726、TCONS_l2_00010607和NONHSAT131696的引物及探针。
4.如权利要求3所述的焦虑症诊断试剂盒，其特征在于所述NONHSAT078768的正向引物如SEQ ID NO.1所示，NONHSAT078768的反向引物如SEQ ID NO.2所示；NONHSAT029028的正向引物如SEQ ID NO.3所示，NONHSAT029028的反向引物如SEQ ID NO.4所示；NONHSAT101077的正向引物如SEQ ID NO.5所示，NONHSAT101077的反向引物如SEQ ID NO.6所示；NONHSAT031726的正向引物如SEQ ID NO.7所示，NONHSAT031726的反向引物如SEQ ID NO.8所示；TCONS_l2_00010607的正向引物如SEQ ID NO.9所示，TCONS_l2_00010607的反向引物如SEQ ID NO.10所示；NONHSAT131696的正向引物如SEQ ID NO.11所示，NONHSAT131696的反向引物如SEQ ID NO.12所示；
上述NONHSAT078768的探针序列如SEQ ID NO.13所示；NONHSAT029028的探针序列如SEQ ID NO.14所示；NONHSAT101077的探针序列如SEQ ID NO.15所示；NONHSAT031726的探针序列如SEQ ID NO.16所示；TCONS_l2_00010607的探针序列如SEQ ID NO.17所示；NONHSAT131696的探针序列如SEQ ID NO.18所示。
5.一种焦虑症诊断基因芯片，其特征在于包括探针和固相支持物，所述探针序列如SEQ ID NO.13～18所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。
6.一种用于评估抗焦虑症药物疗效的lncRNA标志物，所述标记物包括NONHSAG017299、NONHSAT078768、NONHSAT101077、NONHSAT031726、 TCONS_l2_00010607、NONHSAT131696六种lncRNA的组合。
7.一种评估抗焦虑症药物疗效的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有NONHSAG017299、NONHSAT078768、NONHSAT101077、NONHSAT031726、TCONS_l2_00010607、NONHSAT131696的引物和探针。
8.如权利要求7所述的评估抗焦虑症药物疗效的试剂盒，其特征在于所述NONHSAG017299的正向引物如SEQ ID NO.19所示，NONHSAG017299的反向引物如SEQ ID NO.20所示；NONHSAT078768的正向引物如SEQ ID NO.1所示，NONHSAT078768的反向引物如SEQ ID NO.2所示；NONHSAT101077的正向引物如SEQ ID NO.5所示，NONHSAT101077的反向引物如SEQ ID NO.6所示；NONHSAT031726的正向引物如SEQ ID NO.7所示，NONHSAT031726的反向引物如SEQ ID NO.8所示；TCONS_l2_00010607的正向引物如SEQ ID NO.9所示，TCONS_l2_00010607的反向引物如SEQ ID NO.10所示；NONHSAT131696的正向引物如SEQ ID NO.11所示，NONHSAT131696的反向引物如SEQ ID NO.12所示；
所述NONHSAG017299的探针序列如SEQ ID NO.21所示；NONHSAT078768的探针序列如
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SEQ ID NO.13所示；NONHSAT101077的探针序列如SEQ ID NO.15所示；NONHSAT031726的探针序列如SEQ ID NO.16所示；TCONS_l2_00010607的探针序列如SEQ ID NO.17所示；NONHSAT131696的探针序列如SEQ ID NO.18所示。
9.一种评估抗焦虑症药物疗效的基因芯片，其特征在于包括探针和固相支持物，所述探针序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15～18和SEQ ID NO.21所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。
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说 明 书
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一种用于焦虑症诊断的lncRNA标志物、试剂盒及基因芯片
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种用于焦虑症诊断的lncRNA标志物、试剂盒及基因芯片。
背景技术
[0002]广泛性焦虑障碍(GAD，以下简称焦虑症)是最常见的慢性精神障碍之一，女性患病率约为男性的两倍，已婚家庭主妇、低文化程度者更高，给患者造成痛苦和社会功能损害。广泛性焦虑障碍患者频繁地利用医疗资源，且大多需要药物治疗，早期发现和治疗有利于减少不必要的和昂贵的医疗费用。然而，目前对于广泛性焦虑障碍的诊断仍以症状学诊断为主，受主观因素影响较大。在广泛性焦虑障碍中，遗传是一个重要的因素，对广泛性焦虑障碍的遗传学研究可能为疾病的早期诊断和治疗带来突破，这也成为摆在研究者面前的重要课题之一。
[0003]通过对多个物种的转录物组进行注释和高通量测序发现：虽然绝大多数基因组都能够被转录，但只有极少的部分转录本包含具有进化保守性的开放阅读框架序列，因此，这些转录本的大部分不大可能具有编码蛋白质的能力。这些非编码RNA(ncRNA)最初被认为是转录“噪声”，然而近年来越来越多的证据发现，它们可能在细胞的生长和代谢中起到了重要的生物学功能。
[0004]根据转录片段长短可将ncRNA分为两类：小非编码RNA(small ncRNA,<200nt)，长链非编码RNA(lncRNA，>200nt)。近年来Small ncRNA(例如microRNA和siRNA)得到了广泛的关注，相比之下lncRNA的相关研究较少。lncRNA最初也被认为是由RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有生物学功能。lncRNA最初在2002年由日本学者在对小鼠全长cDNA文库的测序中被发现，但由于缺少功能注释，在随后的一段时间里，并未受到研究人员的关注。随着近年来对lncRNA的研究，发现许多lncRNA都具有保守的二级结构，剪切形式以及亚细胞定位，这种保守性和特异性表明它们是具有功能的。但lncRNA的功能相对于microRNA和蛋白质的功能来说更加难以确定，因为目前并不能仅根据序列或者结构来推测它们的功能。[0005]近年来通过对已发现的lncRNA的研究表明，lncRNA可能在表观遗传水平、转录水平、转录后水平都起到调控作用。大量的研究表明，在肿瘤细胞中，某些特定的lncRNA的表达水平会发生改变，这种表达水平的变化能够作为癌症诊断的标志物(有时是非常灵敏的诊断标志物，如前列腺癌中的DD3)和潜在的药物靶点。许多研究也发现，某些lncRNA可能与精神疾病如精神分裂症、阿尔兹海默症(AD)、自闭症等有关。[0006]在精神分裂症和抑郁症关于microRNA的研究发现，精神分裂症和抑郁症患者的外周血单核细胞或血浆中的microRNA水平与正常人相比存在差异性的表达，并且随着药物治疗后精神症状的好转而发生表达水平的改变。越来越多的研究证明，在大脑的发育、神经发生、神经元成熟及突触形成过程中，lncRNA起关键的调控作用。进一步的研究表明，焦虑症的发生、发展中，lncRNA亦起重要作用，并与抗焦虑药物的疗效有相关性。因此，某些lncRNA可成为焦虑症诊断和预测抗抑焦虑物治疗效果的生物标记物。lncRNA的表达水平在焦虑症
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患者 中是否也存在上述变化，相关研究较少。本研究通过基因芯片筛查出在焦虑症患者中差异表达的lncRNA，并对其中的10种lncRNA扩大样本进行RT-PCR验证，旨在发现焦虑症患者中差异表达的lncRNA，并观察它们表达水平的变化与焦虑症的关系。发明内容
[0007]本发明要解决的技术问题是：提供一种用于焦虑症诊断的lncRNA标志物。[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于焦虑症诊断的lncRNA标志物，所述标记物包括NONHSAT078768(PR4)、NONHSAT029028(PR5)、NONHSAT101077(PR6)、NONHSAT031726(PR8)、TCONS_l2_00010607(PR9)、NONHSAT131696(PR10)六种lncRNA的组合。所述NONHSAT078768(PR4)、NONHSAT029028(PR5)、NONHSAT101077(PR6)、NONHSAT031726(PR8)、TCONS_l2_00010607(PR9)、NONHSAT131696(PR10)为数据库中的RNA代号，可以在数据库中检索得到，各lncRNA的具体来源数据库见表6。
[0009]在本发明的第二方面，提供了一种焦虑症诊断试剂盒，其能够测定血液中的NONHSAT078768(PR4)、NONHSAT029028(PR5)、NONHSAT101077(PR6)、NONHSAT031726(PR8)、TCONS_l2_00010607(PR9)、NONHSAT131696(PR10)这六种lncRNA的含量。[0010]在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有NONHSAT078768(PR4)、NONHSAT029028(PR5)、NONHSAT101077(PR6)、NONHSAT031726(PR8)、TCONS_l2_00010607(PR9)、NONHSAT131696(PR10)的引物和探针。[0011]在本发明的一个优选例中，上述NONHSAT078768(PR4)的正向引物如SEQ ID NO.1所示，NONHSAT078768(PR4)的反向引物如SEQ ID NO.2所示；NONHSAT029028(PR5)的正向引物如SEQ ID NO.3所示，NONHSAT029028(PR5)的反向引物如SEQ ID NO.4所示；NONHSAT101077(PR6)的正向引物如SEQ ID NO.5所示，NONHSAT101077(PR6)的反向引物如SEQ ID NO.6所示；NONHSAT031726(PR8)的正向引物如SEQ ID NO.7所示，NONHSAT031726(PR8)的反向引物如SEQ ID NO.8所示；TCONS_l2_00010607(PR9)的正向引物如SEQ ID NO.9所示，TCONS_l2_00010607(PR9)的反向引物如SEQ ID NO.10所示；NONHSAT131696(PR10)的正向引物如SEQ ID NO.11所示，NONHSAT131696(PR10)的反向引物如SEQ ID NO.12所示。
[0012]在本发明的一个优选例中，上述NONHSAT078768(PR4)的探针序列如SEQ ID NO.13所示；NONHSAT029028(PR5)的探针序列如SEQ ID NO.14所示；NONHSAT101077(PR6)的探针序列如SEQ ID NO.15所示；NONHSAT031726(PR8)的探针序列如SEQ ID NO.16所示；TCONS_l2_00010607(PR9)的探针序列如SEQ ID NO.17所示；NONHSAT131696(PR10)的探针序列如SEQ ID NO.18所示。
[0013]在本发明的第三方面，提供了一种焦虑症诊断基因芯片，包括探针和固相支持物组成，所述探针序列如SEQ ID NO.13～18所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。[0014]在本发明的第四方面，提供了一种用于评估抗焦虑症药物疗效的lncRNA标志物，所述标记物为NONHSAG017299(PR3)、NONHSAT078768(PR4)、NONHSAT101077(PR6)、NONHSAT031726(PR8)、TCONS_l2_00010607(PR9)、 NONHSAT131696(PR10)六种lncRNA的组
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合。
在本发明的第五方面，提供了一种评估抗焦虑症药物疗效的试剂盒，其能够测定
血液中的NONHSAG017299(PR3)、NONHSAT078768(PR4)、NONHSAT101077(PR6)、NONHSAT031726(PR8)、TCONS_l2_00010607(PR9)、NONHSAT131696(PR10)六种lncRNA的含量。
[0016]在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有NONHSAG017299(PR3)、NONHSAT078768(PR4)、NONHSAT101077(PR6)、NONHSAT031726(PR8)、TCONS_l2_00010607(PR9)、NONHSAT131696(PR10)的引物及探针。[0017]在本发明的一个优选例中，上述NONHSAG017299(PR3)的正向引物如SEQ ID NO.19所示，NONHSAG017299的反向引物如SEQ ID NO.20所示；NONHSAT078768(PR4)的正向引物如SEQ ID NO.1所示，NONHSAT078768(PR4)的反向引物如SEQ ID NO.2所示；NONHSAT101077(PR6)的正向引物如SEQ ID NO.5所示，NONHSAT101077(PR6)的反向引物如SEQ ID NO.6所
NONHSAT031726(PR8)的反向引物示；NONHSAT031726(PR8)的正向引物如SEQ ID NO.7所示，
如SEQ ID NO.8所示；TCONS_l2_00010607(PR9)的正向引物如SEQ ID NO.9所示，TCONS_l2_00010607(PR9)的反向引物如SEQ ID NO.10所示；NONHSAT131696(PR10)的正向引物如SEQ ID NO.11所示，NONHSAT131696(PR10)的反向引物如SEQ ID NO.12所示。[0018]在本发明的一个优选例中，上述NONHSAG017299(PR3)的探针序列如SEQ ID NO.21所示；NONHSAT078768(PR4)的探针序列如SEQ ID NO.13所示；NONHSAT101077(PR6)的探针序列如SEQ ID NO.15所示；NONHSAT031726(PR8)的探针序列如SEQ ID NO.16所示；TCONS_l2_00010607(PR9)的探针序列如SEQ ID NO.17所示；NONHSAT131696(PR10)的探针序列如SEQ ID NO.18所示。
[0019]所述诊断试剂盒和评估抗焦虑症药物疗效的试剂盒中还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2和DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品；在本发明的一个优选例中，选用了β-Actin作为内参。
[0020]上述人类焦虑症诊断试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是定量PCR扩增试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；所述的试剂例如(但不限于)：阴性对照品、阳性对照品；还可以包括荧光定量PCR反应板、PCR反应板封口膜等。
[0021]可使用本领域技术人员所熟知的多种技术(例如定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测等)测定相关lncRNA在焦虑症患者和健康人群中的水平；在本发明的具体实施方案中，使用了定量PCR的方法。[0022]在本发明的第六方面，提供了一种评估抗焦虑症药物疗效的基因芯片，包括探针和固相支持物，所述探针序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15～18和SEQ ID NO.21所示，所述固相支持物包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯膜。[0023]本发明的有益效果在于：本发明提供了焦虑症生物标记物和预测抗抑郁药物疗效的生物标记物。经临床验证之后，具有较高的特异性和敏感值，有较高的诊断参考价值，lncRNA作为焦虑症特异性生物标记物将带来焦虑症诊断及治疗的革命性改变。[0024]1、焦虑症的诊断将不依靠主观经验判断，而是可以通过lncRNA表达水平这种客观指标检查，进行确诊，提高诊断准确率，简化诊断过程；
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2、有望通过lncRNA模拟物和拮抗物(修饰寡核苷酸)改变特定lncRNA表达水平能
够使异常的基因调控网络和信号通路正常化，进而治疗焦虑症；[0026]3、有望通过检测特定lncRNA表达水平对抗焦虑药物的疗效进行预测；[0027]4、有望通过检测特定lncRNA表达水平对焦虑症患者转归及预后情况进行预测；[0028]5、有望通过lncRNA模拟物和拮抗物对特定焦虑症某种特定症状进行针对性治疗。附图说明
[0029]图1为焦虑症病例组与健康对照组基因表达筛选的火山图；其中X轴是差异倍数以2为底取对数的值，Y轴是p-value值以10为底取负对数的值；灰色点：Fold change绝对值＜2，P值＞0.05的基因；红色点：Fold change绝对值≥2，P值≤0.05的基因，这些为显著性差异基因。
[0030]图2为差异性表达lncRNA的ROC曲线；[0031]图3为差异表达的lncRNA的联合ROC曲线。
具体实施方式[0032]一、研究对象
[0033]本研究获得中国人民解放军第二军医大学临床医院第102医院医学伦理委员会批准，所有受试者或受试家属(监护人)均签署知情同意书。[0034]1.病例组：为2014年5月至2015年2月，在中国人民解放军第102医院精神科门诊和住院的符合GAD诊断标准的患者，入组标准：1.满足美国精神疾病诊断与统计手册第四版(DSM-IV-TR)中GAD的诊断标准；2.汉族，年龄21岁～69岁，小学以上文化；3.采血前1个月内未患其他疾病、服用任何药物且无输血史；4.近3个月未用过任何抗抑郁\\焦虑药物、抗精神病药物。排除标准：1.既往有严重器质性疾病或药物继发的情感障碍、精神障碍或人格障碍；曾有酒精或其它物质滥用史；2.妊娠或哺乳期女性；3.近6个月内进行过无抽搐电休克治疗(MECT)，或长期使用过抗精神病药物；4.需长期合并使用可能影响情绪的药物者，或近期需长期使用中枢神经系统作用的药物；5.对所用研究药物过敏。[0035]2.对照组：为同期体检解放军第102医院工作人员、健康体检人员，入组标准：汉族，年龄在21岁～70岁之间，经过structured clinical interview for DSM-IV,nonpatient edition(SCID-I/NP)检查确认没有患GAD或其它精神疾病，且本人及两系亲属中无精神疾病家族史，本人无严重神经系统疾病或其它严重躯体疾病、严重脑外伤史，采血前1个月内未患疾病、服用任何药物或输血史。[0036]在开展研究前，首先对参加本课题的精神专科医师和研究生进行培训。采用汉密顿焦虑量表(HAMA)、大体评定量表(GAS)、临床疗效总评量表(CGI)在病例入组前、药物治疗3周后、药物治疗6周后分别进行评估。由两位精神科主治医师根据DSM-IV-TR对患者进行诊断，如果出现不一致情况，则请一位精神科主任医师共同讨论后确定诊断。[0037]入组时记录一般情况(姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等)。同样，记录正常对照组一般情况。[0038]二、研究方法[0039]①使用量表
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汉密尔顿焦虑量表(HAMA)：由Hamilton于1959年编制，是目前最经典的焦虑量表，
能够很好地衡定治疗效果，现已在临床和研究中广泛应用。该量表 主要用于评定神经症及其他病人焦虑症状的严重程度，共有14个条目，分为5级评分(0～4分)，能够较好地反映病情严重程度。本研究中使用HAMA量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。
[0041]大体评定量表(GAS)：大体评定量表是评价各类精神疾病症状的量表，在同类量表中是应用最广泛的一种。本研究使用的是美国心理卫生研究所(NIMH)1976年的Spitzer版本，共有10级评定分(1～10分)，根据患者临床症状进行评定。总分越高，说明病情越轻。本研究中使用GAS量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。
[0042]临床疗效总评量表(CGI)：临床疗效总评量表由WHO设计，用于国际精神疾病试点调查(IPSS)的研究，现用以评定临床疗效，适用于任何精神科治疗和研究对象。量表分为病情严重程度(severity of illness，SI)，疗效总评(global improvement，GI)和疗效指数(efficacy index，EI)三个分量表。本研究中使用CGI量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。本研究中使用疾病严重程度分(severity of illness，SI)和疗效总评分(global improvement，GI)进行统计分析。[0043]②资料收集
[0044]入组时记录一般情况(姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等)。由3名精神科主治医师或医师使用汉密尔顿焦虑量表(HAMA)和临床疗效总评量表(CGI)于用药前及用药6周以上对病例组被试进行评定。评定前，所有参与研究人员进行统一培训，统一方法学等，保证施测过程标准化。其中HAMA使用总分和因子分统计，CGI使用疗效总评分(global improvement,GI)统计。[0045]③药物干预[0046]在病例组中，对入组患者采用每日口服丁螺环酮(15mg～45mg)、米氮平(7.5mg～45mg)、西酞普兰(10mg～30mg)治疗，并分别在初诊(治疗前，GAD0)、和第6周(6wk)采血和HAMA评定。根据复诊情况，连续选择自研究起始治疗前、第6周均有记录的病例共26例。[0047]④主要试剂和耗材
[0048]LowInput Quick-Amp Labeling Kit，one-color(24*)(Agilent，货号：5190-2305)；Gene Expression Wash Pack(Agilent，5188-5327)；Gene Expression Hybridization Kit(5188-4242)；RNA Spike In Kit，one-color(5188-5327)；荧光定量PCR引物：Custom Plus TQMN RNA Assays(美国ABI公司)；荧光定量PCR试剂：TaqMan通用混合试剂盒Ⅱ(美国ABI公司，货号：4440047)；反转录试剂盒：QuantiTect Rev.Transcription Kit(QIAGEN，货号：205311)。[0049]⑤主要仪器
[0050]扫描仪(仪器来源：Affymetrix，型号：Scanner 3000)；杂交炉(仪器来源：Affymetrix，型号：Hybridization Oven 640)；洗涤工作站(仪器来源：Affymetrix，型号：Fluidics Station 450)；2100(仪器来源：Agilent，型号：G2939A)；2100振荡器(仪器来源：Agilent，型号：9600)；NanoDrop(Thermo，2000)；PCR仪(ABI，9700)；离心机(eppendorf，5418)；浓缩仪(eppendorf，5301)；离心机(其林贝尔，LX-200)；离心机-1(其林贝尔，LX-8
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300)；振荡器-1(其林贝尔，GL-88B)；磁力搅拌器(其林贝尔，GL-3250B)；金属浴-2(博日，HB-100)；金属浴-3(博日，CHB-100)；电热恒温培养箱(精宏实验设备，XMTD-8222)；冰箱(荣事达，BCD-265F)；ABI9700型PCR仪(美国ABI 公司)；天美CT14RD型台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；NanoDrop1000超微量紫外分光光度计(附电脑1套)(美国Thermo公司)；ABI 7900HT Fast Read-Time PCR System(附电脑1套)(美国ABI公司)；WH-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；JS-400A恒温金属浴(上海培清科技有限公司)；DK-8D数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台(苏净净化设备有限公司)；-81℃超低温冰箱(日本三洋公司)。[0051]⑥基因芯片筛查
[0052]用Agilent Human lncRNA芯片，对精神分裂症患者5人，正常对照5人共10个样本检测和分析。样品总RNA利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量并经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测RNA完整性。RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(AgilentTechnologies)扫描得到原始图像。数据分析：采用Feature Extraction软件(version10.7.1.1,Agilent Technologies)处理原始图像提取原始数据。接着利用Genespring软件(version 12.5；Agilent Technologies)进行quantile标准化和后续处理。标准化后的数据进行过滤，用于比较的每组样本中至少有一组100％标记为“P”的探针留下进行后续分析。利用T检验的p值和倍数变化值进行差异基因和差异lncRNA筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0且P值≤0.05。[0053]⑦总RNA抽提与荧光定量PCR
[0054]对芯片筛查结果中的10种差异表达的lncRNA进行后续的PCR验证。所有被试使用EDTA抗凝管采肘静脉血5ml，采血后轻轻摇动抗凝管使抗凝剂与血液混匀，所有血样在采血后2小时内进行RNA提取。先将Ficoll-Paque PLUS液室温(15-20℃)放置，所有离心过程也应在室温完成。取2mlEDTA抗凝血与等体积平衡液在15ml离心管中用移液管(或移液器)充分混匀(总体积4ml)。用针管抽取3mlFicoll Paque PLUS溶液到新的15ml离心管中，轻轻用移液管(或移液器)沿管壁缓慢滴加准备好的样品(4ml)于分层液面上，注意保持清楚的液面。室温(18-20℃)以400×g离心30-40分钟。用新移液管(或移液器)吸取最上层的血浆与血小板。将单核淋巴细胞置于冻存管中，-80℃保存备用。由实验员每天定时记录冰箱温度。TRIzol(
USA)法提取出血液单核淋巴细胞中的总RNA(包括lncRNA)，具体操作按
照试剂盒说明书进行。按照RNA逆转录试剂盒(TaqMan RNA反转录试剂盒，美国ABI公司)说明书进行逆转录反应。反应总体积为15μL(总RNA5μL，TaqMan MicroRNA Assay 3μL,核酸酶free水4.16ul，RNase抑制剂0.19μL，缓冲液1.5μL，Multiscribe逆转录酶1μL和dNTP0.15μL)，在不同温度下(16℃，42℃，85℃，4℃)进行不同时长(30mins，30mins，5mins，10mins)反应。实时荧光定量PCR按照TaqMan试剂盒(TaqMan通用混合试剂盒II，美国ABI公司)说明书进行。PCR扩增体系总体积为10μL，反应共40个循环。PCR反应Ct值通过7900实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)测定，每个反应重复三次。使用SDS 2.4和DataAssist v3.0软件进行数据读取和分析，选择β-Actin为内参进行数据标准化。[0055]⑧统计学处理
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全部数据使用GraphPad Prism 6.0和SPSS v17.0统计软件进行统计分析。以
lncRNA与内参β-Actin之间阈值环(threshold cycle,Ct)之差计算ΔCt值(Δ Ct＝CtlncRNA-Ctβ-actin)，以ΔCt表示lncRNA的相对表达水平。使用χ2检验分析NC级与GAD组的性别差异；使用两独立样本t检验分析NC组与GAD组ΔCt值差异。使用SPSS version17.0以各lncRNA的ΔCt值为检验变量，以患GAD为状态变量，检验方向设为“较小的检验结果表示更明确的检验”，作受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析；并作多变量观察值的ROC曲线分析，作出各lncRNA的联合ROC曲线分析，求出各检验变量的约登指数(Youden’s index，YI，YI＝sensitivity+specificity-1)的最大值(YImax)和此时对应的灵敏度(敏感度)和特异度。以P＜0.05为差异有统计学意义。[0057]三、研究结果[0058]1、基因芯片分析发现，基因芯片结果显示546种非编码RNA的表达在GAD患者和正常人之间存在差异性表达，其中426种下调120种上调，如图1所示(详细结果见附录)。表1列出了本研究中用于PCR验证的10种lncRNA的芯片筛查结果。[0059]表1芯片分析筛查中差异表达的10种LncRNA
[0060]
[0061]
注：a:TargetID：检测的非编码RNA的ID号；b:FC(abs):组间差异倍数绝对值；
[0062]c:Regulation：组间差异趋势，up为上调，down为下调；d:+/-号表示正/负链[0063]2、病例组与健康对照组的各lncRNA表达水平比较，PR4、PR5、PR6、PR8、PR9、PR10显著上调(P＜0.05或P＜0.01)。结果见表2。
[0064][0065]
表2NC组与GAD组lncRNA的ΔCt值比较
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3、对GAD组和NC组的PR4、PR5、PR6、PR8、PR9、PR10和它们的联合ROC曲线(pre ROC)
进行分析发现，PR4、PR5、PR6、PR8、PR9、PR10的ROC曲线下面积(AUC)在0.601～0.653之间，当YI＝YImax时，灵敏度在0.344～0.891之间，特异度在0.317～0.854之间；联合ROC曲线的AUC达到了0.693；YI＝YImax时，灵敏度0.500，特异度0.878。结果见图2、3，表3。[0068]表3差异表达lncRNA的ROC曲线分析结果
[0069]
[0067]
[0070]
注：a:ROC曲线下面积；b:标准误；c:可信区间的下限；d:可信区间的上限；e:约登
指数(YI，YI＝sensitivity+specificity-1)最大值；f:联合ROC曲线。[0071]4、26例患者各lncRNA在抗焦虑治疗前、治疗6周的比较中，PR3、PR4、PR6、PR8、PR9、PR10在治疗6w时显著下调(P＜0.05或P＜0.01)，结果见表4。[0072]表4女性GAD患者治疗前、6周组a差异性表达lncRNA分子的ΔCt值变化
[0073]
[0074]
注：a:治疗前、6周组在表中分别用GAD0和6wk表示。[0075]5、经抗焦虑治疗，GAD患者的焦虑总分、躯体性焦虑因子分和精神性焦虑因子分在第6周时均显著下降(P＜0.01)。结果见表5。[0076]表5GAD患者在GAD0、6wka焦虑量表分值变化
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注：a:GAD0、6wk分别表示治疗前、治疗6周。表6LncRNA及其来源数据库
[0080]
四、用于焦虑症诊断的基因芯片的制备
[0082]采用序列如SEQ ID NO.13～18所示的六种探针，该部分的核苷酸的平均长度为26个碱基，它的3’端与共有序列1的5’端相接，在它的5’端接上15个碱基组成的无义链寡核苷酸(“CCGGCCTATTATGGCCGG”)，使得每一条核苷酸探针的总长度约为50个碱基。将每条探针的3’端进行氨基修饰，使之能够和玻璃板上的聚合硅发生共价反应从而固定到芯片表面。然后将这些探针分别在用于制备芯片的玻璃板上平行点样三次。
[0083]芯片的制备采用涂有有机硅的Corning GAPS-2玻璃板(目录号：#40003，供应商：Corning Inc.，美国)为支持材料，并用SmartArray点样机(型号SmartArray-48，供应商：CapitalBio Corp，中国)点样，每个探针点的直径为150μm，相邻探针点中心间的距离为240μm，点完探针样品后让玻璃片在室温下干燥24小时，然后按下述方法清洗掉未共价结合的DNA和点样缓冲液：把玻璃片放在一个烧杯中并在烧杯中放一个搅拌子，在25℃用0.2％的SDS洗涤两次，每次5分钟，然后在50℃用蒸馏水洗两次，每次5分钟，再在25℃用0.1M四氢硼二钠溶液洗涤5分钟，用0.2％SDS洗涤三次，每次1分钟，用蒸馏水洗2次，每次1分钟。将玻璃片室温下于空气中彻底晾干后用于杂交检测。
[0084]本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
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